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综述:心房利钠肽的抗肿瘤作用及其基因工程表达
Anticancer Effects of Atrial Natriuretic Peptide and Recombinant Expression of the Peptide
高波 吴晓琰 陆怡
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作者单位:复旦大学附属华山医院老年病科
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自心房利钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP)被发现以来,其扩张血管、降压、增加血管通透性、利钠利尿等心血管系统方面的作用已得到认可,近年来发现ANP在抗肿瘤方面具有潜在的巨大价值。

1 ANP的代谢和组成
1.1 ANP的合成和降解

早在1956年Kisch就发现心房具有内分泌功能[1]。1981年Adolfo de Bold[2]发现第1个利钠肽类激素,它是通过心房心肌细胞的分泌型颗粒旁分泌发挥作用。Potter等[3]将其称为ANP。ANP可由心房、心室、肾脏、脂肪组织及脑细胞表达,通过心房颗粒释放ANP原[4]。合成ANP的基因被称为NPPA 基因(natriuretic peptide A),位于染色体1p36.21,它可合成含151个氨基酸的前ANP原(prepro ANP),加工切断其前25个氨基酸后即变成含126个氨基酸的ANP原(pro ANP)。ANP可激活穿膜的鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase)即利钠肽受体 A(natriuretic peptide receptor A,NPR A)。NPR A可以促进环GMP(cyclic GMP,cGMP )的合成,从而将信息传达到胞内发挥作用。另一种ANP相关的受体是利钠肽受体 C(natriuretic peptide receptor C,NPR C),它可以通过受体介导的摄取和降解作用清除血液循环中的利钠肽类激素。

1.2 ANP的组成、结构和生理功能

pro ANP中包括4个肽类激素,以它们在ANP激素原N端的氨基酸序列进行排序,ANP激素原N端的前30个氨基酸组成长效利钠肽(long acting natriuretic peptide,LANP),31~67共37个氨基酸组成血管扩张肽(vessel dilator,VD),79~98共20个氨基酸组成利钾肽(kaliuretic peptide,KP),99~126共28个氨基酸组成α 人心房利尿肽(α human artrial natriuretic peptide,α hANP)。这4种多肽均在血液循环中存在,它们除有扩张血管、降压、延缓肺动脉高压进展、增加血管通透性、利钠利尿等心血管系统作用外,在抗肿瘤方面也有着潜在的应用价值[5]。

2 ANP与癌症

2.1 ANP的抗癌作用及机制

研究[6]发现ANP来源的心房肽类激素可以直接杀死肿瘤细胞或强力抑制癌细胞DNA的合成,从而抑制癌细胞的生长,而对正常的人体细胞无损伤;它还可缓解抗癌药物对肾脏、肝脏的毒性作用。这4种心脏激素可单独或联合应用于多种肿瘤的治疗。体外实验[7]显示,α hANP、VD、LANP及KP这4种ANP来源的心房肽类激素在体外培养的细胞中24 h可抑制近97%的人胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞以及肺小细胞癌和肺鳞状细胞癌的癌细胞;且在裸鼠体内可使人胰腺癌细胞及人乳腺癌细胞减少80%以上,使人肺小细胞癌细胞减少86%以上。

ANP来源的心房肽类激素主要是以肿瘤细胞中的Ras Raf MEK 1/2 ERK 1/2激酶级联为靶点[7 8]。Ras Raf MEK1/2 ERK1/2信号通路是Ras受上游信号激活后连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶,使下游蛋白磷酸化而产生一系列的级联反应。Raf被Ras激活后,激活下游的丝裂原活化细胞外调节激酶1/2 (mitogen activated protein/extracellular signed regulated kinase 1/2,MEK1/2),MEK1/2进而激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2),活化的ERK1/2进入细胞核,磷酸化特定基因上的特定位点,调控转录。该信号通路在细胞增殖,细胞调亡,细胞分化、癌变等方面起着重要的作用,在多种肿瘤组织与细胞中均可检测到Ras Raf MEK ERK通路的异常过度激活。α hANP、VD、LANP及KP可抑制达95%的基础Ras的活性、98%的MEK 1/2的磷酸化以及97%的基础ERK1/2的激活。ANP来源的心房肽类激素的抗癌机制均是通过进入细胞核抑制肿瘤细胞的DNA合成[7]。进一步的实验[9]证明α hANP、VD、LANP及KP分别抑制有丝分裂原表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)激活Ras的作用,浓度为1 μmoL的α hANP、VD、LANP及KP抑制5 ng/mL的EGF激活Ras的程度分别是33%、73%、79%及45%。对EGF的特异作用可以用5 μmoL的心脏激素抗体阻断,其程度分别是100%、95%、93%及100%。这项研究表明ANP来源的心房肽类激素可以抑制有丝分裂原,如EGF激活Ras的活性及非刺激的基础的Ras活性。

2.2 ANP治疗肿瘤的研究

目前研究ANP相关的肽类激素治疗肿瘤有效的研究综述如下。

小细胞肺癌(体外实验)[10]:浓度为1 μmoL的4种肽类激素(VD、LANP、KP和α hANP)及cGMP 24 h内可降低依次为63%、21%、30%、39%及31%的体外培养的小细胞肺癌的癌细胞数,且在细胞数量减少后的3 d内没有细胞增生;在剂量曲线上,VD为100 μmoL时,24 h内减少92%肺腺癌细胞。

乳腺癌(激素小鼠及裸鼠体内试验)[11]:4种心房肽类激素混合,可杀死54%的小鼠人HTB 132乳腺癌细胞及60%的CRL 2327乳腺癌细胞,同时发现其在未进行外科切除手术情况下使50%的雌性小鼠的HTB 132人乳腺癌消失且不再复发。

前列腺癌(体外实验))[12 13]:在体外实验中,ANP、LANP在浓度为0.01~1 μmoL时抑制Ras磷酸化,抑制Ras GTP激活,通过cGMP途径发挥抗人前列腺癌的作用。在浓度为0.01~10 μmoL时,两者抑制MEK 1/2激酶磷酸化的程度分别是97%、88%,其抑制作用在2 h达高峰,4 h停止,这种抑制作用可被cGMP抗体阻断,cGMP本身抑制MEK 1/2激酶的程度磷酸化的程度可达93%。

黑色素瘤(体外实验))[14]:α hANP、VD、LANP及KP这4种心房肽类激素浓度为1 μmoL时可在24 h内使体外培养的黑色素瘤细胞减少71%,每一种激素可使DNA合成减少达73%,通过cGMP途径发挥抗癌作用。
结肠腺癌(体外实验)[15]:α hANP、VD、LANP及KP在1 mmoL浓度时24 h使体外培养的结肠腺癌细胞减少89%~97%,使其DNA合成减少65%~83%(P<0.001),通过cGMP途径发挥作用。

肺鳞状细胞癌(体外实验)[16]:α hANP、VD、LANP、KP及cGMP抑制体外培养的人癌细胞的程度分别为21%、51%、22%、25%及30%。VD抑制细胞DNA合成达85%,这种抗癌作用由cGMP介导。

胶质母细胞瘤(体外实验)[17]:α hANP、VD、LANP及KP可消除近75%的体外培养的胶质母细胞瘤,通过cGMP途径使DNA合成减少近87%。

血管肉瘤(体外实验)[18]:α hANP、VD、LANP、KP及cGMP 24 h可使体外培养的血管肉瘤细胞分别减少36%、61%、30%、29%及32%,且可抑制68%~85% DNA合成。

甲状腺髓样癌(体外实验)[19]:α hANP、VD、LANP及KP 24 h可使体外培养的甲状腺髓样癌细胞分别减少71%、81%、66%及68%,在癌细胞数量减少的3 d内未出现新的增生,心房肽类激素可以使DNA合成减少65%~84%。

胰腺癌(体外实验及裸鼠体内实验):体外实验中[20],初治无效的胰腺癌细胞对以0.1 μmoL混合的4种心房肽类激素敏感,而正常肺、肾、前列腺及内皮细胞则不受损伤,其作用机制是抑制胰腺癌细胞增殖。体内裸鼠试验[21]发现,与对照相比,通过血管每周两次给α hANP、VD(浓度100 μmoL),28 d后使人胰腺癌细胞生长速度分别减少68%和92%[21]。在人胰腺癌的裸鼠模型中连续28 d按体质量皮下注射3 nmol/(min·kg)α hANP、VD、LANP及KP,可减少80%、33%、20%及14% 的胰腺癌细胞;治疗后试验组动物尽管没有痊愈,但与对照组相比较,肿瘤体积减少10%。与原发性胰腺癌相比,转移的胰腺癌动物NPR A受体减少33%~55%[22] ,其抗肿瘤机制是抑制裸鼠胰腺癌细胞细胞核内DNA的合成。另一项免疫组化研究[8]发现,ANP来源的心房肽类激素在胰腺癌细胞的细胞质和细胞核聚集,这与其在恶性肿瘤细胞中降低DNA合成的抗肿瘤作用一致,同时发现在胰腺癌的血管内皮细胞及成纤维细胞中这项作用受到局限。此项研究将这些抑制生长的激素定位在细胞核中,它们在核内抑制DNA的合成,且很可能与促进生长的激素相互干扰,这就是其在体内、外抑制胰腺癌细胞生长的病因学[8]。

3 ANP的合成

3.1 化学合成

ANP来源的心房肽类激素可作为一种多肽类药物在肿瘤的综合治疗中发挥良好作用。然而目前仅美国南佛罗里达大学心脏激素中心开展了大量关于α hANP、VD、LANP及KP这4种心房肽类激素的抗肿瘤实验。其原因主要是多肽合成不仅复杂而且十分昂贵,在实验室研究中尚不能大规模推广。

目前多肽大规模工业化制备绝大部分都靠化学合成,在多肽合成仪中采用固相、液相或液固并用的化学方法合成。多肽化学合成的每一步都要去掉其副产物。氨基酸序列长度越长,化学合成将越繁杂,副产物也将越多,继而成本也将越高。另外,多肽生产过程中会产生大量的有机溶剂废液(生产1 kg 多肽药物约产生1000 L有机废液),对环境也会产生极大的污染。

3.2 ANP基因工程

基因工程生产心房肽类药物应该是一种产量大且相对廉价的方法,但尚在起步阶段。多肽药物基因工程合成困难的主要原因是多肽分子量较蛋白质小,在细胞中表达后不稳定,容易被降解。为了增加其稳定性,可将多肽基因与载体蛋白质基因结合,以融合蛋白的形式在原核系统或真核系统中表达,最后再切断融合蛋白以获得目的多肽。由于多肽在融合蛋白中所占比例小(1/10),因此产量较低。为提高获得率,可考虑采用串联多肽基因的方法,但其问题是融合蛋白的切断无论是酶切或化学切断都很困难。也可采用真核系统分泌型质粒表达多肽的方法,对表达的蛋白质进行翻译后的加工和修饰,高密度发酵培养表达量高,但从大量培养基中回收目的多肽相当困难。

已有研究[23]可用基因工程合成α hANP,但距大规模生产还有待时日。

4 展望

随着化学合成及基因工程合成ANP类多肽的进展,我们有望将其从实验室的研究转入实际的临床试验,这不仅为临床肿瘤提供一种新的治疗手段,而且这类多肽特定的生物学活性将使其给治疗过程中所带来的风险远远低于目前的各种治疗手段。

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